Introducción

La amelogenina es una proteína presente en el esmalte dental cuyo gen codificante en el ser humano se encuentra en los cromosomas X (Xp22.1-Xp22.3) e Y (Yp 11.2) [1]. La deleción de este gen origina una enfermedad denominada amelogénesis imperfecta ligada al cromosoma X [2].

Existen divergencias entre la secuencia del gen de la amelogenina localizado en el cromosoma X (AMELX) y el localizado en el cromosoma Y (AMELY), debidas tanto a sustituciones puntuales de bases como a inserciones de fragmentos de diferente longitud [1, 3, 4], presentes o ausentes en estos dos alelos (figura 1). A pesar de estas diferencias de secuencia, la existencia de zonas que poseen una homología completa permite la amplificación por PCR (Polymerase Chain Reaction) simultánea en ambos alelos de un fragmento mediante un único par de cebadores. Esta posibilidad está en la base de la utilización del test de la amelogenina para el diagnóstico del sexo. La dicha prueba de la amelogenina se ha impuesto como un método rápido, económico y fiable de determinación del sexo, y han aparecido a lo largo del tiempo numerosos protocolos basados en amplificaciones de determinadas regiones de este gen.

La identificación del sexo a partir de una muestra de ADN obtenida de cualquier fuente biológica (sangre, pelos, saliva, restos óseos, etc), mediante el test de la amelogenina tiene un interés crucial en el ámbito de la medicina forense [5], pero también ha sido propuesta su utilización como medida de control de calidad en estudios epidemiológicos [6], para el diagnóstico prenatal del sexo [7] o en antropología [8].

No obstante, en los últimos años, se han comunicado fallos de esta técnica en determinados individuos, que pueden llevar a un diagnóstico erróneo del sexo, con las consecuencias que este hecho puede tener en la investigación llevada a cabo.

Dada la amplísima utilización de esta técnica en el ámbito forense, nuestro objetivo es presentar una síntesis de los diferentes métodos de diagnóstico del sexo basado en la amplificación de fragmentos del gen de la amelogenina y además, describir las posibles fuentes de error de esta técnica que pueden conducir a atribuciones espurias del sexo correspondiente a una determinada muestra.

Métodos

Amplificación por PCR de fragmentos AMELX y AMELY

Como se ha mencionado anteriormente, debido a la presencia o ausencia de inserciones tanto en AMELY como en AMELX (figura 1), han aparecido múltiples protocolos de amplificación de regiones de inserción que generarán fragmentos amplificados de diferente tamaño.

La tabla 1 muestra diferentes secuencias de cebadores propuestos. Después de una revisión de los diferentes protocolos de amplificación comunicados en la literatura, encontramos tres grandes patrones de diseño de PCR. La mayoría de autores utilizan oligonucleótidos sintetizados para amplificar una región que presenta una inserción de 6 pares de bases (pb) (AAAGTG) en el intrón 3 de AMELY (figura 1), no estando estos seis nucleótidos en AMELX. Le siguen en frecuencia las amplificaciones de un fragmento que engloba otra inserción de 3 pb (GAT) (figura 1), presente también de forma exclusiva en AMELY. Por último existen protocolos que emplean cebadores que amplifican una amplia región de inserción de 177 pb en AMELX. Estos últimos fragmentos amplificados son grandes (Y790, X 977 e Y1475, X1295 pb, respectivamente) y engloban otras inserciones /deleciones menores que alteran levemente la diferencia final de tamaño de los fragmentos amplificados.

Mención aparte merecen los kits comerciales de identificación como AmpFlSTR^® (Applied Biosystems, Foster City, USA) y POWERPLEX^® (PROMEGA, Madison , USA). Estos preparados permiten determinar un número variable de STRs (Short Tandem Repeats) además de amplificar los fragmentos AMELX y AMELY. La práctica totalidad de ellos emplean protocolos que amplifican el fragmento que engloba la inserción de 6pb en AMELY mencionada anteriormente.

Detección de fragmentos AMELX y AMELY

Se han propuesto diversas técnicas para la detección de los fragmentos amplificados específicos X e Y. No obstante, el método más usado en la determinación del sexo mediante el test de la amelogenina es la electroforesis capilar asociada a detección de la fluorescencia procedente del fragmento amplificado. Esto es posible ya que, en la amplificación previa, uno de los cebadores estará marcado con un colorante fluorescente que será detectado a la salida del capilar de electroforesis. Los kits comerciales disponibles, siguen mayoritariamente este patrón de detección de fragmentos AMELX y AMELY.

No obstante, han sido propuestos otros métodos de detección de fragmentos amplificados. Uno de ellos es la electroforesis en geles de agarosa, que, si bien no es una técnica de alto rendimiento, presenta la ventaja de ser económica. Los protocolos diseñados para una posterior electroforesis en agarosa [22,17] requieren diferencias grandes de tamaño ente los fragmentos para su fácil discriminación, y por tanto amplifican regiones que incluyen la gran inserción de 177 pb presente en AMELX (figura 1). La figura 2 muestra el resultado de una electroforesis de agarosa a partir del producto de PCR obtenido mediante los cebadores descritos por Eng B et al (22), utilizados usualmente en nuestro laboratorio.

Una técnica alternativa que emplea geles de agarosa es una PCR anidada donde existe una amplificación previa de la zona que incluye la inserción de 6 pb en AMELY y posteriormente una amplificación aleloY-específica sobre la región de la inserción que sólo generará un producto PCR en caso de sexo masculino [24].

Otros métodos menos frecuentemente comunicados son los ensayos de hibridación con sondas fluorescentes como el sistema TaqMan [13] que implican el diseño de sondas específicamente sintetizadas para la hibridación sobre la región de la inserción.

La pirosecuenciación también ha sido utilizada en la detección de AMELX y AMELY. En esta técnica se detecta la secuencia insertada de 3 pb en AMELY [9]. Por último cabe citar modelos de identificación basados en cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante o DHPLC [20], en los cuales generalmente se diferencian fragmentos con inserciones/deleciones, pero destaca un protocolo en concreto de los descritos por Shinka T y colaboradores, en el cual los dos fragmentos amplificados tienen el mismo tamaño, diferenciándose AMELX y AMELY por una única sustitución de una base por otra. Esta es, en cuanto a método, una opción altamente innovadora, ya que no utiliza la clásica discriminación de fragmentos X e Y en función de su tamaño molecular.

Fuentes de discrepancia entre el resultado de la amplificación de fragmentos AMELX y AMELY, y el sexo legal de un individuo

Recientemente han sido comunicados fallos en la tipificación del sexo basada en amplificación de fragmentos del gen de la amelogenina. Además de estas fuentes de error, varias circunstancias adicionales pueden generar resultados en los cuales el sexo genético no coincida con el sexo legal, oficialmente registrado de un individuo.

Deleciones de AMELY

En 1998, Santos FR y colaboradores comunicaron la existencia en algunos individuos normales de sexo masculino, de deleciones del alelo AMELY, que generaban la ausencia del amplificado correspondiente al sexo masculino, y eran interpretados erróneamente como mujeres [25]. La presencia de deleciones en la región Yp11.2 del cromosoma Y que afectan el gen de la amelogenina [26] son especialmente frecuentes en población del subcontinente indio (1,85%) [27,28,29] siendo más raras en caucásicos (0,02% en Austria) (15). Estas deleciones son propias del haplogrupo J2 [28].

Mutaciones en las áreas de hibridación de los cebadores

Otra causa de error en la tipificación genética del sexo se debe a la presencia descrita de mutaciones en las secuencias de hibridación de los cebadores empleados en el test de la amelogenina [30; 31]. En estas condiciones, el cebador no tendrá una homología completa respecto a la secuencia de hibridación en el gen de la amelogenina, y la PCR puede no producir amplificación del fragmento AMELY o AMELX, especialmente si esta discrepancia cebador-patrón se localiza en el extremo 3’ del cebador.

Otras causas de discrepancias entre el test de la amelogenina y el sexo legal

Existen otras circunstancias, ajenas al funcionamiento de la prueba genética de la amelogenina, en las cuales pueden producirse discrepancias entre el resultado de esta prueba y el sexo legal del individuo.

En caso de mujeres embarazadas de un feto de sexo masculino, la presencia en sangre materna, en determinados periodos de la gestación, de DNA procedente del feto puede generar un resultado masculino del test en estas mujeres gestantes [32, 33]. Tanto es así que se ha propuesto el test de la amelogenina practicado en sangre materna para la detección del sexo del feto [24]. Por otra parte, los transplantes alogénicos de médula ósea, generan una situación de quimerismo, en la cual coexisten células procedentes del donante y del receptor. Esta circunstancia puede generar resultados del test de la amelogenina no coincidentes con el sexo del individuo receptor cuando una mujer recibe un transplante de médula ósea procedente de un donante masculino. De hecho, y aprovechando este fenómeno, se ha utilizado el test de la amelogenina, sola o en combinación con otros STRs como método de control de evolución del injerto de médula ósea [34,35]. Además, cabe tener en cuenta que en estas circunstancias, el test de la amelogenina generará resultados discrepantes si la muestra analizada procede de sangre periférica o de raíz pilosa [36].

Por último, únicamente citaremos, ya que no es el propósito de esta revisión, los estados intersexuales, originados bien por diferentes alteraciones cromosómicas relativas a los cromosomas sexuales, bien por anomalías en la respuesta a las hormonas sexuales. Tal es el caso del síndrome de insensibilidad a los andrógenos, la disgenesia gonadal y el déficit de 5 alfa reductasa, además de las situaciones de transexualismo. En todos estos casos es posible la existencia de discrepancias entre el sexo genético y el fenotipo que determina el sexo legal del individuo.

Conclusiones

El test de la amelogenina se ha impuesto como una prueba de uso diario en los laboratorios forenses de todo el mundo. Múltiples son los protocolos diseñados con el fin de amplificar unas regiones concretas del gen de la amelogenina y también múltiples son los sistemas de detección, que varían sensiblemente en coste y rendimiento.

No obstante, hemos de tener presente que existen circunstancias en las cuales este test puede generar resultados que no correspondan al sexo fenotípico del individuo. El analista forense ha de tener consciencia de estas circunstancias, lo que permitirá en no pocas ocasiones, una interpretación adecuada de la prueba y podría evitar llegar a conclusiones erróneas con los perjuicios que de ellas se deriven.

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Dirección para correspondencia:
Dr. Francesc Francès.
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